Isolement HLA

Méthode en une seule étape pour l'isolement in vitro de lymphocytes purs.

INTRODUCTION À LA TECHNIQUE

Les premières méthodes utilisées pour séparer les lymphocytes du sang total consistaient à mélanger le sang avec un composé provoquant l'agrégation des érythrocytes. Ces agrégats sédimentaient alors au fond, laissant les lymphocytes dans la couche supérieure. Les granulocytes sédimentaient également, car ils sont plus gros que les lymphocytes et ont tendance à s'agréger légèrement. Boyum (1964) a mis au point un système dans lequel l'agent d'agrégation n'est pas mélangé directement au sang. Au lieu de cela, l'agent agglomérant est combiné à un composé à haute densité (par exemple, le diatrizoate de sodium), et l'ensemble du mélange est soigneusement déposé en couche sur le dessus. Lorsque les érythrocytes atteignent l'interface des deux phases liquides, ils entrent en contact avec l'agent agglomérant, forment de gros agrégats et se déposent au fond. Les granulocytes se déposent également, ce qui entraîne une concentration élevée de lymphocytes juste au-dessus de l'interface.

En utilisant Ficoll® comme agent d'agrégation, Boyum (1968) a mis au point une technique centrifuge en une seule étape pour isoler les lymphocytes. Thornsby et Brallie (1970) ont légèrement modifié cette technique pour isoler les lymphocytes avant les tests de cytotoxicité et la culture des lymphocytes. Harris et Ukayiofo (1969) ainsi que Ting et Morris (1971) ont souligné la fiabilité de cette méthode pour le sang frais, le sang anticoagulé conservé et le sang cadavérique.

ISOLYMP®

Isolymph® est une solution aqueuse de diatrizoate de sodium et de Ficoll 400®*, ayant une densité de 1,077 ± 0,001 g/ml. (9,0 g de diatrizoate de sodium et 5,7 g de Ficoll 400® pour 100 ml). Isolymph® est fourni dans un flacon transparent de 100 ml muni d'un bouchon en caoutchouc pour le prélèvement à l'aide d'une seringue stérile. Le diatrizoate de sodium est le sel sodique de l'acide 3,5-diacétamido-2,4,6-triiodobenzoïque. Il forme des solutions à faible viscosité et à haute densité, ce qui le rend idéal pour cette application. Étant sensible à la lumière, Isolymph® doit être conservé à l'abri de la lumière. Une conservation à température ambiante est suffisante, mais une conservation à 4-6 °C augmentera la durée de conservation.

Matériaux et solution
  1. Two siliconized 10 ml glass tubes for each sample (refer to notes for details).
  2. Siliconized Pasteur pipettes (refer to notes for details).
  3. Two siliconized glass centrifuge tubes for each sample. A convenient size is 15 ml with an internal diameter of 1.3 cm for larger sample volumes (refer to notes for details).
  4. A centrifuge.
  5. A sterile syringe and needle for the sterile withdrawal of Isomlymph from its container.
  6. Isolymph®: 3 ml required per sample (refer to notes for details on larger samples).
  7. 20 ml of balanced salt solution for each sample (refer to notes for details).

Fresh blood is recommended to ensure high lymphocyte viability.

1. Put 2 ml of defibrinated or anticoagulant-treated blood into a siliconized 10 ml tube and add an equal amount of balanced salt solution. Mix by drawing in and out of a Pasteur pipette.

2.  Ficoll 400® is a registered trademark of Pharmacia Fine Chemicals AB., Uppsala, Sweden

  1. Transfer the lymphocyte layer to a clean centrifuge tube.
  2. Add at least three volumes of TRIS-balanced salt solution to tube 1 and suspend the lymphocytes by gently drawing them in and out of a Pasteur pipette,
  3. Centrifuge at 60-100 x g for 10 minutes at l8-20°C.
  4. Remove the supernatant.
  5. Add 6-8 ml of TRIS-balanced salt solution and resuspend the cells as above.
  6. Centrifuge at 60-100 x g for 10 minutes at 18-20 °C.
  7. Remove the supernatant.
  8. Resuspend the lymphocytes in a suitable medium for your subsequent work.
  1. Transfer the lymphocyte layer to a clean centrifuge tube.
  2. Add at least three volumes of TRIS-balanced salt solution to tube 1 and suspend the lymphocytes by gently drawing them in and out of a Pasteur pipette,
  3. Centrifuge at 60-100 x g for 10 minutes at l8-20°C
  4. Remove the supernatant.
  5. Add 6-8 ml of TRIS-balanced salt solution and resuspend the cells as above.
  6. Centrifuge at 60-100 x g for 10 minutes at 18-20 °C.
  7. Remove the supernatant.
  8. Resuspend the lymphocytes in a suitable medium for your subsequent work.
  1. All glassware that contacts the blood sample should be siliconized. Immerse it in a 1% silicon solution for 10 seconds, wash with distilled water six times, and dry in an oven.
  2. To ensure reproducibility of the lymphocyte technique, use the same volume of blood and centrifuge tubes of uniform size. This is critical because the taller the blood column, the longer the centrifugation time needed, and the higher the erythrocyte contamination. For larger samples, use a wider diameter tube to keep the height of the blood sample and Isolymph consistent.
  3. The optimal centrifugation temperature is 18-20°C; at higher temperatures (37°C), red cell aggregation increases, but lymphocyte viability decreases. At lower temperatures (4°C), the separation process takes longer, reducing lymphocyte viability.
  4. Defibrinated blood is preferred for this procedure, but anticoagulants such as ACD, CPD, Heparin, EDTA, or Citrate can also be used.
  5. Prepare TRIS-balanced salt solution.
  6. The erythrocyte contamination in the lymphocyte suspension is usually between 1-5% of the total cell count.
Solution 1g/L
D-Glucose (anhydrous)1 .0
CaCl2 • 2HO0.0074
MgCl 20.1992
KCl0.4026
TRIS17.565
Dissolve in 950 ml distilled water. Adjust pH to 7.6 using 1N HCI, q.s. to one liter
Solution IIg/L
NaCl8.19
Working TAIS-balanced salt solution:

Mix 1 volume solution I with 9 volumes of solution II. Prepare fresh weekly.

HLA Isolation

  1. Boyium, A (1964): Separation of White Blood Cells. Nature 204, p. 793.
  2. Boyium. A. (1968): Separation of Leucocytes from Blood end Bone Marrow. Scand. J.Clin. Lab Invest. 21 Suppl. 97
  3. Favour C B. (1964): Antigen-antibody Reaction in Tissue Culture. Immunological Methods, Ed. J. R. Ackroyd, p.195-223. Blackwell Scientific Publ., Oxford.
  4. Harris, R. and Ukaejiofo. E. V. (1969): Rapid Preparation for Lymphocytes for Tissue Typing. Lancet 327. 7615.
  5. Ting. A and Morris. P. J (1971): A Technique for Lymphocyte Preparation from stored Heparinized Blood. Vox Sang, 20. 561.
  6. Thorsby E. and Bratlie, A (1970): A Rapid Method for Preparation of Pure Lymphocytes Suspensions. Histocompatibility testing. 1970 Ed P. I. Terasaki. p. 655 Munksgaard Copenhagen